尖锐湿疣应该做哪些检查？

    一  醋酸白试验
    用3-5%醋酸外涂疣体2-5分钟  病灶部位变白稍隆起  肛门病损可能需要15分钟  本试验的原理是蛋白质与酸凝固变白的结果  HPV感染细胞产生的角蛋白与正常的未感染上皮细胞产生的不同  只有前者才能被醋酸脱色  醋酸白试验检测HPV的敏感性很高  它比常规检测观察组织学变化还好  但偶尔在上皮增厚或外伤擦破病例中出现假阳性  假阳性变白迹象显得界限不清和不规则  美国CDC提示  醋酸白试验并不是特异试验  且假阳性较常见  
    二  免疫组织学检查
    常用过氧化物酶抗过氧化物酶方法（即PAP）  显示湿疣内的病毒蛋白  以证明疣损害中有病毒抗原  HPV蛋白阳性时  尖锐湿疣的浅表上皮细胞内可出现淡红色的弱阳性反应  
    三  组织化学检查
    取少量病损组织制成涂片  用特异抗人类乳头瘤病毒的抗体作染色  如病损中有病毒抗原  则抗原抗体结合  在过氧化物酶抗过氧化物酶（PAP）方法中  核可被染成红色  此法特异性强且较迅速  对诊断有帮助  
    四  病理检查
    主要为角化不全  棘层高度肥厚  乳头瘤样增生  表皮突增厚  延长  其增生程度可似假性上皮瘤样  刺细胞和基底细胞并有相当数量的核分裂  颇似癌变  但细胞排列规则  且增生上皮和真皮之间界限清楚  其特点为粒层和刺层上部细胞有明显的空泡形成  此种空泡细胞较正常大  胞浆着色淡  中央有大而圆  深嗜碱性的核  通常真皮水肿  毛细血管扩张以及周围较致密的慢性炎性浸润  Bushke-loewenstein巨大型尖锐湿疣  表皮极度向下生长  代替了其下面的组织  易与鳞状细胞相混  故须多次活检  若有缓慢发展之倾向   则为一种低度恶变的过程  即所谓疣状癌  
    五  基因诊断
    迄今  HPV难于用传统的病毒培养及血清学技术检测  主要实验诊断技术是核酸杂交  近年来发展的PCR方法具有特异  敏感  简便  快速等优点  为HPV检测开辟了新途径  
    （一）标本的采集及处理
    1．标本的采集和预处理：用刮板或生理盐水浸润的棉棒从阴道和宫颈外口取分泌物和细胞  在作细胞学检查的同时  将标本放入5ml含有0.05%硫柳汞的PBS中  用PBS离心（3000g  10min）洗涤2次  沉积细胞重悬于1mlPBS中  取0.5ml细胞悬液抽提DNA  
    2．标本核酸的提取：按1体积细胞悬液加10倍体积的细胞裂解液（10mmol/L Tris-HCl  pH 7.4  10mmol/L EDTA  150mmol/L NaCl  0.4%SDS  1.0mg/ml蛋白酶K）37℃下处理过夜;且等体积酚/氯仿(1:1)  氯仿/异戊醇（24:1）各抽提2次；加1/10体积3mol/L NaAc（pH 5.2）及2.5倍体积无水乙醇置-20℃ 2h或过夜沉淀DNA；加1体积乙醇洗涤1次；用60μl含RNA酶(100μg/ml)的TE液(10mmol/L Tris-HCl  pH 8.0  1.0mmol/L EDTA)溶解DNA  37℃温育30min  
    （二）PCR扩增
    1． 引物设计和合成：HPV基因组可分为早期区（E）和晚期区（L）  每区含一系列开放读码框架（ORF）  序列分析表明  各型HPV的非编码区及E1  E6  E7和L1区均有保守序列  Manos等从HPVL1区中选择保守序列设计合成引物MY11和MY09见表1  该引物与HPV 6  11  16  18及33型有互补序列  也可扩增其它型HPV  
    Manos等设计的HPVL1通用引物
    MY11：GCMCAGGGWCATAAYAATGG
    MY09：CGTCCMARRGGAWACTGATC
    表1
    HPV型

    MY11的第1个硷基位置

    MY09的第1个硷基位置

    PCR产物长度（bp）

    6

    6722

    7170

    448

    11

    6707

    7155

    448

    16

    6584

    7035

    451

    18

    6558

    7012

    454

    33

    6539

    6987

    448


    M=A+C    R=A+G  W=A+T  Y= C+T
    表2列述了Manos等设计的寡核苷酸探针   公用混合探针序列选自HPVL1区中另一保守序列  可与MY11和MY09引物产生的多种HPVL1 PCR扩增产物杂交：型特异探针只与相应HPV型有互补序列  用于检出的HPV分型  
    表2 Manos等设计的HPVL1 PCR产物探针 
    公用混合探针

    GP1 CTGTTGTTGATACTACACGCAGTAC

    GP2 CTGTGGTAGATACCACWCGCAGTAC

    第一个硷基位置

    HPV6 6771 HPV11 6757 HPV16 6631

    HPV18 6607 HPV33 6588



    2．PCR反应试剂：Taq DNA聚合酶（2U/ml）  10mmol/L dNTP贮备液（dATP  dCTP  dGTP  dTTP各10mmol/L）  10×PCR缓冲液(500mmol KCl  40mmol/L MgCl2  100mmol/L Tris-HCl  pH 8.5)  100μmol/L MY11和MY09贮备液  灭菌的玻璃蒸馏器制备的蒸馏水  
    3．PCR扩增方法和程序：以100μl PCR反应液,用无菌0.5ml硅化塑料离心管为反应管进行扩增反应   
    （1）实验前配制预混反应试剂并分装   预混反应试剂包括除标本DNA外的其它各种PCR反应试剂  每支反应管中含有的PCR反应试剂见表3  
    表3 每支反应管中的PCR反应试剂 
    反应试剂

    体积（μl）

    终浓度

    10×PCR缓冲液

    10

    1×PCR缓冲液

    dNTP贮备液

    2

    200μmol/L每种dNTP

    MY11贮备液

    0.5

    500μmol/L

    MY09贮备液

    0.5

    500μmol/L

    Taq DNA聚合酶

    0.5

    2.5μ

    灭菌蒸馏水

    75.5



    总计

    90.0





    （2）各反应管依次加入10μl标本和90μl预混反应试剂  
    （3）加入80-100μl石蜡油   在台式离心机上快速离心数秒钟  使各反应试剂收集于油层下  目前  PCR试剂已商品化  反应体积为25μl  使用时只加入标本DNA即可  
    （4）将反应管置PCR扩增仪上   循环参数为95℃ 30s  55℃ 40s  72℃ 50s循环35次  最后72℃延伸5min  
    4．每次试验应设阳性及阴性对照   以载有HPV的重组质粒（每反应为100pg）或含有HPV的细胞系（如Caski  HeLa）DNA为阳性对照  以无HPV的人细胞系DNA为阴性对照  
    （三）扩增产物的检测和分析 
    1． 凝胶电泳：扩增反应结束后   取出反应管  冷却至室温  取10μl扩增产物用5%-7%聚丙烯酰胺凝胶或1.5%琼脂糖电泳  溴化乙锭染色  紫外分析仪下分析结果  分子量约为450bp处出现明显的DNA带  
    2． 核酸杂交：如果凝胶电泳无清楚的DNA或需确定DNA带的特异性时   可用标记的公用混合探针和（或）型特异探针作Southern吸印杂交  斑点杂交验证  
    按照标准方法制32P ATP标记的寡核苷酸探针   需达到约107cpm/pmol特异活性  杂交液中需含有2×106-5×106cpm探针/ml  在55℃缓慢振荡下杂交2-3h  随后于30-55℃下用洗涤液（2×SSC  0.1%SDS）迅速冲洗杂交膜  除去多余探针  然后进行洗膜  其条件依所用探针而异：公用混合探针  55℃洗膜10min；MY12  MY13及MY16探针  56-57℃下10 min  并换液重洗1次；MY14及WD74探针  58-59℃下10min  亦换液重洗1次  
    用PCR方法检测HPV比核酸杂交方法优越   其敏感性高  GP-PCR方法以凝胶电泳直接分析结果  可检出标本中200个拷贝的HPV DNA  若以核酸杂交检测PCR产物  敏感性提高  能检出10个拷贝的HPV DNA  
    鉴于PCR技术的高度敏感性   以生殖道脱落细胞为检材足以满足试验要求  避免了活检取材  研磨组织繁杂操作  一般情况下  PCR扩增产物经凝胶电泳  观察产生的DNA可直接作出诊断  因此  PCR技术检测HPV实验周期短  简便快速