淋病应该做哪些检查？

实验室检查：
    淋球菌实验室检查包括涂片培养检查淋球菌抗原检测药敏试验及PPNG测定基因诊断
    (一)涂片检查：
    取患者尿道分泌物或宫颈分泌物作革兰氏染色在多形核白细胞内找到革兰氏阴性
    双球菌涂片对有大量脓性分泌物的单纯淋菌性前尿道炎患者此法阳性率在90%左右可以初步诊断女性宫颈分泌物中杂菌多敏感性和特异性较差阳性率仅为50-60%且有假阳性因此世界卫生组织推荐用培养法检查女病人慢性淋病由于分泌物中淋球菌较少阳性率低因此要取前列腺按摩液以提高检出率
    咽部涂片发现革兰氏阴性双球菌不能诊断淋病因为其他奈瑟菌属在咽部是正常的菌群另外对症状不典型的涂片阳性应作进一步检查
    (二)培养检查：
    淋球菌培养是诊断的重要佐证培养法对症状很轻或无症状的男性女性病人都是较敏感的方法只要培养阳性就可确诊在基因诊断问世以前培养是世界卫生组织推荐的筛选淋病的唯一方法目前国外推荐选择培养基有改良的Thayer-Martin(TM)培养基和New York City(NYC)培养基国内采用巧克力琼脂或血琼脂培养基均含有抗生素可选择地抑制许多其他细菌生长在36℃70%湿度含5%-10%CO2(烛缸)环境中培养24-48小时观察结果培养后还需进行菌落形态革兰氏染色氧化酶试验和糖发酵试验等鉴定培养阳性率男性80%-95%女性80-90%
    (三)抗原检测
    1.固相酶免疫试验(EIA)：可用来检测临床标本中的淋球菌抗原在流行率很高的地区而又不能作培养或标本需长时间远送时使用可以在妇女人群中用来诊断淋球菌感染
    2.直接免疫荧光试验：通过检测淋球菌外膜蛋白I的单克隆抗体作直接免
    疫荧光试验但目前在男女二性标本的敏感不高特异性差加之实验人员的判断水平故该实验尚不能推荐用来诊断淋球菌感染
    (四)基因诊断
    1.淋球菌的基因探针诊断
    淋球菌的基因探针诊断所用的探针有：质粒DNA探针染色体基因探针和rRNA基因探针
    (1)质粒DNA探针
    ① 隐蔽质粒DNA探针淋球菌质粒分为三种：接合性质粒分子最大为36kb DNA; 耐药性质粒包括两个质粒DNA长分别为5.6kb和7.1kb;隐蔽质粒4.2kb其中隐蔽质粒存在于96%的临床淋球菌分离株中其它奈瑟菌不含有此质粒故可用它的序列作为特异DNA探针检测淋球菌Torres采用核酸杂交技术检测淋球菌所用探针为隐蔽质粒用该探针对134株淋球菌和131株相关菌株的检测有124株淋球菌杂交反应阳性占93%还可与个别其它的奈瑟菌出现交叉反应对测定探针的敏感性实验表明可检出102CFU淋球菌研究证明隐蔽质粒中CPPB基因序列在所有的淋球菌染色体中(包括不含该质粒的菌株)因此CPPB基因探针具有良好的特异性和敏感性Torres等用CPPB基因探针检测了201份临床标本 采用非放射性地高辛标记系统 其敏感性和特异性分别为95%和98%
    ② 耐药性质粒DNA探针
    淋球菌的抗药质粒可分为：①产青毒素酶淋球菌(PPNG)其β-内酰胺酶阳性;②具有高水平的质粒介导的耐四环素淋球菌(TRNG)
    PPNG菌株是1976年首次在实验室分离得到的该菌中含有编码产青毒酶的基因该基因既可整合于染色体上也可出现在质粒DNA中而后者居多称之为产青毒素酶质粒质粒有二种大小分别为7.4kb和5.3kbPescador1998年设计一特异的检测淋球菌编码β-内酰胺酶基因的探针采用酶化学发光法标记液相杂交用测光计测是特异杂交体的光量在4h内可检测104-105CFU的PPNG菌株TRNG菌株虽对四环素耐药但通常对β-内酰胺酶类及喹诺酮类抗菌素敏感因此在实验室药敏检测中可归为敏感细菌Pescador用抗四环素淋球菌(TRNG)tetm基因的寡核苷酸探针,该基因介导抗四环素,用酶化学发光标记,液相杂交,4h内可直接从临床标本中检出含有tetm基因的1.5×104CFu的淋球菌
    (2)染色体探针
    染色体探针包括已知功能的基因探针如菌毛DNA探针和paI基因探针这些基因在淋球菌感染人细胞的过程中起着重要作用;未知功能的基因探针这些探针序列与染色体的特定序列互补但目前还不知这些基因序列的功能以上两种染色体探针由于在淋球菌中互补序列的拷贝数较低检测灵敏度较低因此一般用的不多除非有特殊的研究目的
    (3)rRNA基因探针
    rRNA基因探针是将与rRNA互补的DNA作为探针该探针的靶序列是rRNA序列rRNA的基因探针的特点是：①可以增加探针检测的灵敏度rRNA基因探针可同时检测rRNA分子和DNA分子;②rRNA具有进化上的保守性;③杂交方法简便快速;④由于rRNA的含量较高标本不需增菌美国Gen-Probe公司生产的淋球菌检测探针PACE C是以rRNA 及其基因为检测靶序列采用放射性标记在2h内可以完成检测Peter用这种探针检测395个临床标本结果灵敏度和特异性分别为92.9%99.4%他认为PACE C系统筛查临床标本中淋球菌是一个可靠的方法该探针还可以检测无症状淋球菌感染者这是目前培养难于达到的
    2淋球菌的基因扩增检测
    上面讲述的探针技术检测淋球菌的方法虽然比培养方法在灵敏度特异性和方便性上有了很大的提高但其仍有一定的局限性如多数情况下需要标本的淋球菌浓度很高PCR技术和连接酶链反应的出现进一步提高了检测淋球菌的灵敏性它具有快速灵敏特异简便的优点可以直接检测临床标本中极微量的病原体
    (1)淋球菌DNA的提取
    ①培养菌的DNA提取
    将培养得到的淋球菌以102cfu/ml的浓度溶于碱性裂解液中裂解裂解液组成为：1M NaCl 1M NaOH和1%Sodium dodecyl sulphate将裂解液混匀后煮沸1min然后用100μl 的1M Tris pH7.0中和碱性裂解液用Tris平衡酚提抽一次酚—氯仿抽提一次然后用无水乙醇或异丙醇沉淀DNA提取的DNA溶于30μl蒸馏水或TE缓冲液中
    ②临床棉拭子标本的提取
    将贴有分泌物的棉拭子在2ml的无菌生理盐水中或PBS缓冲液中挤压洗1min以便将标本尽量溶于溶液中将棉拭子弃去悬浮液于2-3000r/min离心5min吸去上清液细胞重新溶于100μl 1×PCR缓冲液其中含Tween 20 0.45%,蛋白酶K 200μg/ml细胞悬浮液于50-60℃温浴1h,然后95℃加热10min以灭活蛋白酶K,12000 r/min离心10min,上清液含DNA模板
    (2)PCR引物的设计
    由于淋球菌隐蔽质粒CPPB基因在淋球菌染色体中和4.2kb隐蔽质粒中都有存在同时在96%的淋球菌中都有该隐蔽质粒因此很多PCR引物设计在CPPB基因区
    靶基因 引物序列 片段长度(bp)
    CPPB NG1 5′GTT TGG CTG GTT GAT TCA AG 3′ 633
    NG2 5′GCA AGA TTT CCG ATTT GGC G 3′
    CPPB HO1 5′GCT ACG CAT ACC CGC GTT GC 3′ 390
    HO2 5′CGA AGA CCT TCG AGC AGA CA 3′
    rRNA 引物1 5′-AGG CTG TTG CCA ATA TCG GC-3′ 206
    引物2 5′-ACA CTC GAG TCA CCC AGT TC-3′
    CPPB GC1 5′CTT ATC GTT TGG CTG GTT GAT TC 3′ 435
    GC2 5′ACC AAG ACC AAA GGT TTG ACA CTG 3′
    GC3 5′ATT TTC CAG TGT CAA AC 3′ 241
    GC4 5′TAT TCA AGC CCT ATC TG 3′
    (3)PCR扩增
    取淋球菌DNA提取液2μl加入28μl的反应液中最终PCR反应液中含dNTP各100μmol/L引物各0.5μmol/LTaqDNA聚合酶1UMg2+ 1.5mmol/L,加无菌石蜡油30μl1000r/min离心30s进行PCR扩增循环反应条件：94℃变性1min然后94℃ 30s57℃1min72℃1min共30个循环最后72℃延伸5min
    扩增产物于2%的琼脂糖凝胶电泳30min溴化乙锭染色紫外灯下可见扩增的DNA荧光条带分子大小应与所用引物扩增靶序列的大小一致
    (4)PCR的灵敏性和特异性
    由于CPPB在不含有隐蔽质粒的淋球菌染色体上也会含有CPPB基因再加96%的淋球菌都会有隐蔽质粒因此用CPPB作为靶序列的引物具有极高的敏灵性实验证明一般传统一步PCR(GC1-GC2)方法可以检出3个淋球菌而用单管巢式PCR(GC2-GC4)可以检出≤0.3淋球菌(9个CPPB基因)这些引物经特异性实验只能扩增淋球菌的DNA而对非淋球菌奈瑟氏菌扩增不出特异产物
    (5)单管巢式PCR方法
    是在传统巢式PCR的基础上将两对PCR引物作特殊的设计巢式外侧两个引物(GC1GC2)为25b退火温度比较高(68℃)巢式内侧两个引物GC3-GC4为17b退火温度较低(46℃)PCR反应液的其它成分与一般PCR相同这样通过控制退火温度(68℃)使外侧引物先行扩增经过20-30次循环后(第一次PCR)再降低退火温度(46℃)使内侧引物以第一次PCR产物为模板进行巢式扩增该PCR的灵敏度可达到检出0.3个淋球菌
    (6)淋球菌连接酶链反应(LCP)检测方法
    目前PCR检测淋球菌的方法被广泛地使用其特异性灵敏性不断提高同时另一种基因诊断技术——连接酶链反应(LCP)也以其高特异高灵敏性被应用于淋球菌的检测中LCP 与PCR不同之处在于LCP 用四对引物所用酶是连接酶连接酶可以将两条相邻引物连接起来连接起来的两条引物可以作为另两条引物的模板后者在连接酶作用下连接又可作为模板如此进行30-40次循环LCP所用的模板处理方法与PCR模板制备相等LCP所用的探针除了可以设计在CPPB基因上也可以设计在染色体基因序列上例如opa-1基因美国Abbott实验室在opa-1基因的48bp长的区域内设计了4个LCP探针由于opa-1基因在淋球菌的染色体中有11次重复因此该组LCP探针具有高灵敏性和特异性LCP反应过程：
    将模板加入LCP反应液中LCP反应液：20mmol/L Tris-HCl pH7.6;100 mmol/L KCl 10 mmol/L MgCl2;1 mmol/L EDTA; 10 mmol/L NAD+;10 mmol/L DTT,有标记物的两个相邻探针各40fmol/L未标记的探针各40fmol/L15U耐热连接酶反应条件：97℃1s55℃1s62℃50s其40循环100μl反应产物加入酶标板微孔中进行显色反应最后用酶标仪读取光值根据Buimer的实验证明LCP在检测男性尿道棉拭子标本的灵敏度为100%尿液标本为88.9%女性宫颈棉拭子标本为95.4%LCP方法的特异性高达100%这一点明显高于PCR的特异性避免了假阳性的发生
    3. 临床基因诊断淋球菌的注意事项
    目前临床检测淋球菌的基因诊断方法主要采用PCR方法但是该方法在临床检测中应注意几个问题
    (1)引物设计 除了以上所列的淋球菌PCR引物外还可从在其它基因上设计但
    是引物序列应具有特异性因为细菌的染色体较大许多基因序列并没有搞清楚;同时细菌之间或近或远有一定的同源性而且细菌所含质粒序列间也存在同源性因此设计引物一定要进行基因数据库比较分析同时进行特异性和灵敏性实验从中选择引物进行临床检测
    (2)临床标本处理 对临床标本来讲PCR模板要求越纯越好这就要求在采集标本时要取到准确的位置对于无症状患者要适当多采样以保证采集到病原体细菌另外由于临床标本成分比较复杂有时简单处理的标本PCR扩增效果并不理想这可能是由于杂质过多造成的,需要进一步纯化如用酚一氯仿抽提法纯化结果将会好转这种纯化方法比较麻烦,目前已有商品化的DNA纯化试剂盒,可以较简便地从临床标本中提取高纯度的DNA
    (3)PCR产物的检测方法 不久以前临床PCR检测淋球菌几乎都采用电泳的方法进行PCR产物的鉴定该方法存在许多问题如由于肉眼观察的主观性而造成假阳性和假阴性的结果目前用杂交显色法代替电泳法提高了结果判断的特异性和灵敏性
    总之PCR方法与LCP方法比传统的培养法在灵敏性和特异性上有了很大的提高时间也大大缩短随着基因诊断技术的不断改进PCR方法与LCP方法在淋球菌的检测将会成为常规的检测方法
    (五)药敏试验：在培养阳性后进一步作药敏试验用纸片扩散法做敏感试验或用琼脂平皿稀释法测定最小抑菌浓度(MIC)用以指导选用抗生素
    (六)PPNG检测：β-内酰胺酶用纸片酸度定量法使用Whatman I号滤纸PP-NG
    菌株能使其颜色由蓝变黄阳性为PPNG阴性为N-PPNG